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本制品是基于荧光及可视化双显色法LAMP扩增检测技术开发的，专门用于艰难梭状芽孢杆菌研究检测的试剂盒。

艰难梭状芽孢杆菌(Clostridioides difficile)，简称艰难梭菌，为革兰阳性、严格厌氧产芽孢杆菌，芽孢抵抗力强，环境中可长期存活，主要经粪-口传播。广谱抗生素破坏肠道正常菌群后，产毒菌株大量增殖，释放毒素A、B，引发抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎，严重可致中毒性巨结肠甚至死亡，是重要院内感染病原体。因此，检测研究艰难梭菌具有重要意义。

1. 即开即用，用户只需要提供DNA样品。
   
2. 恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
   
3. 含可见光和荧光染料，既可以用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
   
4. 检测灵敏度一般比PCR高10倍以上。
   
5. 特异性高，根据艰难梭状芽孢杆菌DNA保守序列设计4条特异引物，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
   
6. 一般30分钟内出结果，比PCR快。
   
7. 上样量大，对20μL的反应体系，最大样品加样量高达到14μL。
   
8. 提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
   
9. 本制品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
   
10. 本制品足够50次20μL体系的荧光及可视化LAMP扩增。
    
11. 本制品只可用于科研。

1. 用自选方法纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
   
2. 如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照(PPC，用确定为阳性的样本为起始材料)和一个样品制备阴性对照(PNC，用确定为阴性的样本为起始材料)。

3. 首次使用本试剂盒时，先短暂离心装引物-探针冻干粉的离心管，然后加入55μL超纯水充分混匀，得到20×艰难梭状芽孢杆菌LAMP引物混合液，放冰上待用。未用完的需要-20℃保存。
   
4. 反应设置：第一次使用本试剂盒时，请把50μL的Bst DNA聚合酶2.0加入到4×LAMP Master Mix(双染料)中，轻柔颠倒20次充分混匀，然后再取用。如果有N+2个DNA纯化样品，则最好设置N+4个LAMP扩增。多出的两个分别用于LAMP扩增阳性对照和LAMP扩增阴性对照。在N+4个PCR管中加入下列成分：
   

   成分	N+2个 样品管	LAMP 阴性对照	LAMP 阳性对照
   4×LAMP MasterMix(已加酶)	各5μL	5μL	5μL
   20×艰难梭状芽孢杆菌LAMP引物混合液	各1μL	1μL	1μL
   N+2个样品DNA	各14μL	－	－
   超纯水	－	14μL	－
   第2步所得阳性对照的10倍稀释液	－	－	14μL

5. 放荧光定量PCR仪中进行扩增。循环参数是60次循环，每个循环为65℃保温1分钟，采集SYBR通道的荧光信号。不推荐使用金属浴或水浴，因为其温度波动大，导致假阳性率很高。

6. 电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。LAMP阳性对照必须有正常LAMP条带(200bp左右的梯形扩增产物)，LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下图，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：
   
   
   
   
7. 肉眼观察：PPC和LAMP阳性对照的反应液必须呈黄色，PNC和LAMP阴性对照的反应液必须呈红色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性对照结果呈阳性，阴性对照结果呈阴性，则实验有效，可以继续分析待测样品的情况。若待测样品管的颜色接近LAMP阳性对照管，则说明样品为阳性；若接近LAMP阴性对照，则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见下图(9阴性、10阳性)。
   
   
   
   
8. 荧光分析(仅限于用qPCR仪进行反应的场景)：PPC和LAMP阳性对照的反应液将有标准的S扩增曲线，PNC和LAMP阴性对照的反应液将没呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性对照结果呈阳性，阴性对照结果呈阴性，则实验有效，可以继续分析样品的情况。若待测样品的荧光曲线为S型，则该样品为阳性，如果为平线，则该待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。